使用ggtree实现进化树的可视化和注释

层次聚类的侧重点在于分类，把距离近的聚在一起。而进化树的构建可以说也是一个聚类过程，但侧重点在于推测进化关系和进化距离(evolutionary distance)。

层次聚类的输入是距离，比如euclidean或manhattan距离。把距离近的聚在一起。而进化树推断是从生物序列（DNA或氨基酸）的比对开始。最简单的方法是计算一下序列中不匹配的数目，称之为hamming distance（通常用序列长度做归一化），使用距离当然也可以应用层次聚类的方法。进化树的构建最简单的方法是非加权配对平均法（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean, UPGMA），这其实是使用average linkage的层次聚类。这种方法在进化树推断上现在基本没人用。更为常用的是邻接法（neighbor joining），两个节点距离其它节点都比较远，而这两个节点又比较近，它们就是neighbor，可以看出neighbor不一定是距离最近的两个节点。真正做进化的人，这个方法也基本不用。现在主流的方法是最大似然法(Maximum likelihood, ML)，通过进化模型（evolutionary model)估计拓朴结构和分支长度，估计的结果具有最高的概率能够产生观测数据（多序列比对）。另外还有最大简约法和贝叶斯推断等方法用于构建进化树。

是最常用的存储进化树的文件格式，如上面这个树，拓朴结构用 newick 格式可以表示为：

(B,(A,C,E),D);

括号最外层是根节点，它有三个子节点，B, (A,C,E)和D，而节点(A,C,E)也有三个子节点A，C和E。

加上分支长度，使用:来分隔：

(B:6.0,(A:5.0,C:3.0,E:4.0):5.0,D:11.0);

比如A:5.0代表的是A与其父节点的距离是5.0。

内部节点也可以有label，写在相应的括号外面，如下所示：

(B:6.0,(A:5.0,C:3.0,E:4.0)Ancestor1:5.0,D:11.0);

codeml_file <- system.file("extdata/PAML_Codeml/mlc", package="ggtree")  tree_text <- readLines(codeml_file)[375:376]  tree_text

## [1] "w ratios as labels for TreeView:"                                                                                                                                                                                                                                                                                          ## [2] "(K #0.0224 , N #0.0095 , (D #0.0385 , (L #0.0001 , (J #0.0457 , (G #0.1621 , ((C #0.0461 , (E #0.0641 , O #0.0538 ) #0.0001 ) #0.0395 , (H #0.1028 , (I #0.0001 , (B #0.0001 , (A #0.0646 , (F #0.2980 , M #0.0738 ) #0.0453 ) #0.0863 ) #1.5591 ) #0.0001 ) #0.0001 ) #0.0549 ) #0.0419 ) #0.0001 ) #0.0964 ) #0.0129 );"

这种做法只能展示一元信息，而且修改节点label真心是个脏活，满满的都是不爽，我心中理想的方式是树与注释信息分开，注释信息可以方便地通过图层加上去，而且可以自由组合。于是着手开发 ggtree 。 ggtree 是个简单易用的R包，一行代码

ggtree(read.tree(file))

进化树的解析

除了 ggtree 之外，我所了解到的其它画树软件在画树的时候都把树当成是线条的集合。很明显画出来的进化树就是在画一堆线条，但是线条表示的是父节点和子节点的关系，除此之外没有任何意义，而节点在进化树上代表物种，叶子节点是我们构建进化树的物种，内部节点是根据叶子节点推断的共同祖先。我们所有的进化分析、推断、实验都是针对节点，节点才是进化树上有意义的实体。这是 ggtree 设计的基础， ggtree 只映射节点到坐标系统中，而线条在 geom_tree 图层中计算并画出来。这是与其它软件最根本的不同，也是 ggtree 能够简单地用图层加注释信息的基础。

扩展ggplot2

有很多可视化包基于ggplot2实现，包括各种 gg 打头的，号称扩展了ggplot2，支持图形语法(grammar of graphics)，我并不认同。虽然基于 ggplot2 产生的图，我们可以用theme来进一步调整细节，用scale_系列函数来调整颜色和标尺的映射，但这些不足以称之为支持图形语法，图形语法最关键核心的部分我认为是图层和映射。

像ggphylo, OutbreakTools和phyloseq这几个包都有基于ggplot2的画树函数，但其实都不支持图形语法，它们所实现的是复杂的函数，画完就完事了，用户并不能使用图层来添加相关的信息。

如果在 OutbreakTools 这个包中：

if (show.tip.label) {  p <- p + geom_text(data = df.tip, aes(x = x, y = y, label = label),  hjust = 0, size = tip.label.size)  }

如果show.tip.label=FALSE，当函数返回p 时 df.tip 就被扔掉，用户想要再加 tip.label 就不可能了。 ggphylo 和 phyloseq 都是类似的实现，这些包把树解析为线条，所以节点相关的信息需要额外的 data.frame 来存储，并且只有极少数的预设参数，比如上面例子中的tip.label。在上面的例子中，用户连更改 tip.label 的颜色都不可能，更别说使用额外的注释信息了。

library(ggplot2)  library(ggtree)  set.seed(2015-11-26)  tree <- rtree(30)  ggplot(tree, aes(x, y)) + geom_tree()

ggtree函数是 ggplot() + geom_tree() + xlab(NA) + ylab(NA) + theme_tree() 的简单组合。

ggtree(tree)

想要加 tip.label，用 geom_tiplab 图层，并且ggplot2的图层都可以直接应用 ggtree。

ggtree(tree) + geom_tiplab() + geom_point(color='firebrick')

树的操作与注释

ggtree提供了多个函数可以把clade放大缩小(scaleClade)，折叠(collapse)和展开(expand)，位置调换和旋转，以及分类(groupOTU, groupClade)。

nwk <- system.file("extdata", "sample.nwk", package="ggtree")  tree <- read.tree(nwk)  p <- ggtree(tree)  cp <- ggtree(tree) %>% collapse(node=21) + ggtitle('collapse')  ep <- cp %>% expand(node=21) + ggtitle('expand')  hp <- p %>% hilight(node=21) + ggtitle('hilight')  rp <- hp %>% rotate(node=21) + ggtitle('rotate')  library(gridExtra)  grid.arrange(cp, ep, hp, rp, ncol=2)

支持多种文件格式

ggtree支持的文件格式包括Newick, Nexus, NHX和jplace。

上面已经展示了Newick格式，下面的例子是NHX格式：

nhxfile = system.file("extdata", "ADH.nhx", package="ggtree")  nhx <- read.nhx(nhxfile)  ggtree(nhx, ladderize=F) + geom_tiplab() + geom_point(aes(color=S), size=8, alpha=.3) +  theme(legend.position="right") +  geom_text(aes(label=branch.length, x=branch), vjust=-.5) +  xlim(NA, 0.3)

支持解析多种软件的输出文件

我们知道FigTree是针对 BEAST 的输出设计的，可以把BEAST的统计推断拿来给树做注释，但很多的进化分析软件并没有相应的画树软件支持，用户很难把信息展示出来。

ggtree支持ape, phangorn, r8s, RAxML, PAML, HYPHY, EPA, pplacer和BEAST的输出。相应的统计分析结果可以应用于树的注释。可以说ggtree把这些软件分析的结果带给了R用户，通过ggtree的解析， 这些进化分析结果可以进一点在R里进行处理和统计分析，并不单单是在ggtree中展示而已。

RAxML bootstrap分析

raxml_file <- system.file("extdata/RAxML", "RAxML_bipartitionsBranchLabels.H3", package="ggtree")  raxml <- read.raxml(raxml_file)  ggtree(raxml) + geom_text(aes(label=bootstrap, color=bootstrap)) +  scale_color_gradient(high='red', low='darkgreen') +  theme(legend.position='right')

multiPhylo也是支持的，所以100颗bootstrap树可以同时用一行代码展示出来。

btree_file <- system.file("extdata/RAxML", "RAxML_bootstrap.H3", package="ggtree")  btree = read.tree(btree_file)  ggtree(btree) + facet_wrap(~.id, ncol=10)

如果不分面，这100颗树会重叠画在一起，这也能很好地展示bootstrap分析的结果，bootstrap值低的clade，线条会比较乱，而bootstrap值高的地方，线条一致性比较好。

PAML

使用BaseML预测的祖先序列，ggtree解析结果的同时会把父节点到子节点的subsitution给统计出来，可以直接在树上注释：

rstfile <- system.file("extdata/PAML_Baseml", "rst", package="ggtree")  rst <- read.paml_rst(rstfile)  p <- ggtree(rst) + geom_text(aes(label=marginal_AA_subs, x=branch), vjust=-.5)  print(p)

不同于BaseML以碱基为单位，CodeML预测祖先序列，以密码子为单位。`ggtree`定义了一个操作符 %<% ，如果有相同的注释信息要展示，可以用tree object来更新tree view。

rstfile <- system.file("extdata/PAML_Codeml", "rst", package="ggtree")  crst <- read.paml_rst(rstfile)  p %<% crst

像上面的例子，用crst来更新p，就是用crst画出来的树+注释。对比两图，可以发现BaseML和CodeML推测的祖先序列是稍有不同的。

CodeML的dN/dS分析，我们可以直接把数据拿来给树上色。同样道理分类数据也可以拿来上色。

mlc_file <- system.file("examples/mlc", package="ggtree")  mlc <- read.codeml_mlc(mlc_file)  ggtree(mlc, aes(color=dN_vs_dS)) +  scale_color_continuous(limits=c(0, 1.5), high='red', low='green', oob=scales::squish, name='dN/dS') +  theme(legend.position='right')

使用用户定义数据

进化树已经被广泛应用于各种跨学科的研究中，随着实验技术的发展，各种数据也更易于获得，使用用户数据注释进化树，也是ggtree所支持的。

nwk <- system.file("extdata", "sample.nwk", package="ggtree")  tree <- read.tree(nwk)  p <- ggtree(tree)   dd <- data.frame(taxa = LETTERS[1:13],  place = c(rep("GZ", 5), rep("HK", 3), rep("CZ", 4), NA),  value = round(abs(rnorm(13, mean=70, sd=10)), digits=1))  ## you don't need to order the data  ## data was reshuffled just for demonstration  dd <- dd[sample(1:13, 13), ]  row.names(dd) <- NULL  print(dd)

在上面的例子中，使用一个分类数据和一个连续型数据，输入的唯一要求是第一列是taxon label。ggtree中定义了操作符%<+%，来添加数据。添加之后，用户的数据对ggplot是可见的。可以用于树的注释。

p <- p %<+% dd + geom_text(aes(color=place, label=label), hjust=-0.5) +  geom_tippoint(aes(size=value, shape=place, color=place), alpha=0.25)  p+theme(legend.position="right")

ggtree还支持用户把自己的数据和树保存为jplace格式。

更多的实例请参考 vignette 。

ggtree允许把不同软件的分析结果整合在一起，同时在树上展示或者比较结果。在我们提交的论文中，使用了整合BEAST和CodeML的例子，在树上展示dN/dS、时间轴、氨基酸替换、clade support values、物种和基因型 (genotype）等多维信息，6种不同的信息同时展示在一颗进化树上，这是个复杂的例子，我们在附件1中展示了可重复的代码。如果有兴趣，可以留意一下我们的文章。

其它好玩的功能

我们把树当成节点的集合，而不是线条的集合，这一点回归到了进化树的本质意义上，使这一实现成为可能。而支持图形语法，与ggplot2的无缝衔接又让注释变得更加容易`ggtree为我们打开了各种注释和操作的可能性。甚至于可以创造出好玩的图，比如使用showtext来 加载图形化的字体 、 用emoji来画树 、使用 图片来注释树 等等。

一个比较正经又好玩的是使用PhyloPic数据库上的图形。

pp <- ggtree(tree) %>% phylopic("79ad5f09-cf21-4c89-8e7d-0c82a00ce728", color="steelblue", alpha = .3)  pp + geom_tiplab(align=T, linetype='dashed', linesize=.5) + geom_tippoint(color='firebrick', size=2)

另一个好玩又为我们展现各种可能性的是 subview 函数，它使得图上加小图变得特别容易。并且已经被应用于 地图上加饼图 。解决这个问题的初衷在于，想要给节点加饼图注释。有了subview函数之后，这会变得很容易，当然我还没有写出给节点加饼图的函数，因为我还没有这个需求，得有一些实际的数据做参考，这样才能够设计出更易用的函数呈现给用户。

很多的功能还在开发之中，有问题/建议请及时在 Github 上报告(中英文都可以)。