用FastQC检查高通量测序原始数据的质量
本篇文章，主要参考了阳光1986的博文（http://www.dxy.cn/bbs/topic/31324367），自己测序的分析结果作为对比，加在其中了。
1.简介
当二代测序的原始数据拿到手之后，第一步要做的就是看一看原始reads的质量。常用的工具就是fastqc ( http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ )。
fastqc的详细使用说明： http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Help/
2. 安装
$ wget http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/fastqc_v0.11.3.zip $ unzip fastqc_v0.11.3.zip $ cd FastQC/ $ chmod 755 fastqc $ echo "export PATH=`pwd`:$PATH" >> ~/.bashrc $ source ~/.bashrc $ fastqc –help
3. 服务器上用命令行来运行fastqc
fastqc [-o output dir] [--(no)extract] [-f fastq|bam|sam] [-c contaminant file] seqfile1 .. seqfileN
-o 用来指定输出文件的目录，fastq是不能新建目录的。输出的结果是.zip文件，默认自动解压缩，如果加上--noextract参数则不解压缩。
-f 用来强制指定输入文件格式，默认会自动检测。
-c用来指定一个contaminant文件，fastqc会把overrepresented sequences去这个contaminant文件里搜索。contaminant文件的格式是"Name/tSequences"，#开头的行是注释。
-q 会进入沉默模式，即不出现下面的提示：
Started analysis of target.fq
Approx 5% complete for target.fq
Approx 10% complete for target.fq
4. 结果解析
如果输入的fastq文件名是target.fq，fastqc的输出的压缩文件将是target.fq_fastqc.zip。解压后，查看html格式的结果报告。结果分为如下几项：
0) summary
结果分为绿色的"PASS"，黄色的"WARN"和红色的"FAIL"。“You should treat the summary evaluations therefore as pointers to where you should concentrate your attention and understand why your library may not look random and diverse. ”
1) Basic statistics
2) Per base sequence quality
quality就是Fred值，-10*log10(p)，p为测错的概率。所以一条reads某位置出错概率为0.01时，其quality就是20。横轴代表位置，纵轴quality。红色表示中位数，黄色是25%-75%区间，触须是10%-90%区间，蓝线是平均数。若任一位置的下四分位数低于10或中位数低于25，报"WARN"；若任一位置的下四分位数低于5或中位数低于20，报"FAIL".
3) Per Sequence Quality Scores
每条reads的quality的均值的分布：横轴为quality，纵轴是reads数目。当出现上面的 第二幅 图 的情况时，我们就会知道有一部分reads具有比较差的质量。当峰值小于27（错误率0.2%）时报"WARN"，当峰值小于20（错误率1%）时报"FAIL"。
4) Per Base Sequence Content
对所有reads的每一个位置，统计ATCG四种碱基（正常情况）的分布：
如果建库足够均匀，reads的每个位置应当是没有差异的，所以GC含量的线应当平行于X轴，反映样品（基因组、转录组等）的GC含量。当部分位置GC含量出现bias时，往往提示我们有overrepresented sequence的污染。当所有位置的GC含量一致的表现出bias时，往往代表文库有bias (建库过程或本身特点)，或者是测序中的系统误差。当任一位置的GC含量偏离均值的5%时，报"WARN"；当任一位置的GC含量偏离均值的10%时，报"FAIL"。
5) Per Base GC Content
对所有reads的每个位置，统计GC含量。
如果建库足够均匀，reads的每个位置应当是没有差异的，所以GC含量的线应当平行于X轴，反映样品（基因组、转录组等）的GC含量。当部分位置GC含量出现bias时，往往提示我们有overrepresented sequence的污染。当所有位置的GC含量一致的表现出bias时，往往代表文库有bias (建库过程或本身特点)，或者是测序中的系统误差。当任一位置的GC含量偏离均值的5%时，报"WARN"；当任一位置的GC含量偏离均值的10%时，报"FAIL"。
6) Per Sequence GC Content
对所有reads的每个位置，统计GC含量。
红线是实际情况，蓝线是理论分布（正态分布，均值不一定在50%，而是由平均GC含量推断的）。 曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差（overrepresented reads）。形状接近正态但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差。偏离理论分布的reads超过15%时，报"WARN"；偏离理论分布的reads超过30%时，报"FAIL"。
7) Per Base N Content
8) Sequence Length Distribution
reads长度的分布
当reads长度不一致时报"WARN"；当有长度为0的read时报“FAIL”。
9) Duplicate Sequences
统计序列完全一样的reads的频率。测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication，这是正常的现象，但如果duplication的程度很高，就提示我们可能有bias的存在（如建库过程中的PCR duplication）
横坐标是duplication的次数，纵坐标是duplicated reads的数目，以unique reads的总数作为100%。 上图的情况中，相当于unique reads数目～20%的reads是观察到两个重复的，～7%是观察到三次重复的，依此类推。
可 以想象，如果原始数据很大（事实往往如此），做这样的统计将非常慢，所以fastqc中用fq数据的前200,000条reads统计其在全部数据中的重 复情况。重复数目大于等于10的reads被合并统计，这也是为什么我们看到上图的最右侧略有上扬。大于75bp的reads只取50bp（不知道怎么选 的）进行比较。但由于reads越长越不容易完全相同（由测序错误导致），所以其重复程度仍有可能被低估。
10 Overrepresented Sequences
如 果有某个序列大量出现，就叫做over-represented。fastqc的标准是占全部reads的0.1%以上。和上面的duplicate analysis一样，为了计算方便，只取了fq数据的前200,000条reads进行统计，所以有可能over-represented reads不在里面。而且大于75bp的reads也是只取50bp。如果命令行中加l入了-c参数，则 出现的over-represented sequence 会从contaminant_file里面找匹配的hit（至少20bp且最多一个mismatch），可以给我们一些线索。 当发现超过总reads数0.1%的reads时报”WARN“，当发现超过总reads数1%的reads时报”FAIL“。
正文到此结束
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